白介素8放射免疫分析的建立及初步应用

 中国免疫学杂志 2000年第4期第16 免疫学技术与方法

作者:颜光涛 郝秀华 王录焕

单位:颜光涛(解放军总医院基础医学研究所生化研究室, 北京 100853);郝秀华(解放军总医院基础医学研究所生化研究室, 北京 100853);王录焕(解放军总医院基础医学研究所生化研究室, 北京 100853

关键词:白介素8;放射免疫分析休克;损伤

  摘 要 目的:建立高灵敏和高特异性的IL-8放射免疫分析方法。方法:用人工重组白细胞介素8(IL-8)多次免疫兔和豚鼠,获取高效价 IL-8抗体。用氯氨T法制125I标记IL-8,经Sephadex G-25 纯化,抗原抗体反 应采用平衡一步法,4培养24 h后经PR试剂分离结合和游离的标记抗原。结果 :该法测定范围0.29.6 ng/ml,最低检出量为0.1 ng/ml,批内和批间误差分别 小于5%10%。正常人血清含量为(0.35±0.01) ng/ml(n=64)。人粒细胞系HL-60细胞 体外培养24 h,钙离子载体A23187内毒素多糖(LPS)可显著提高细胞释放IL-8,而蛋白激酶 C激活剂(PMA)却没有明显的促IL-8释放。另外,兔失血性休克灌注损伤后24 h内不 同时间血清中IL-8水平明显高于对照。结论:该方法是一种简便、灵 敏和特异的IL-8分析方法,可用于人和兔血清以及细胞培养清液IL-8分析。

  中国图书分类 R392

The establish and primary application of interleukin 8 radioimmunoassay

YAN Guang-Tao HAO Xiu-Hua WANG Lu-Huan

  (Research Laboratory of Biochem istry,Basic Medical Institute,General Hospital of PLA,Beijing 100853

  Abstract ObjectiveTo found a high sensitive and high sp ecific radioimmunoassay method for interleukin 8.Methods:The high effect antibody was obtained by immunizing rabbits and guinea pigs wi th recombinant IL-8 many times. The IL-8 was iodinated with chloramine-T meth ods and purified by the SephadexG-25 chromatograph column. The reaction betwe en antigen with antibody was carried out by one step balance method and cultured i n 4 for 24 h,then separated binding and free antigen by PR reagent.Results:The determine range of this method was about 0.29.6 ng/m l,lowest detesting level was 0.1 ng/ml,error in group and between group were les s than 5% and 10% respectively. The level of IL-8 in normal peoples was(0.35± 0 .01) ng/ml(n=64). The liberation of IL-8 from HL-60 celline was obviously promot ed by cultured with calcium ionophore(A23187) and LPS for 24 h in vitr o but protein kinase C agonist(PMA) without the same effect as A23187 and LPS. Otherwise, the level of IL-8 in serum of rabbits was significantly higher than that of self-control at different time point within 24 h after hemorrhagic shock and reperfusion.Conclusion:This method was simp le,high sensitive and specific for detecting interleukin 8 in human and rabbit s erum as well as supernatant of cell culture.

  Key words Interleukin 8 Radioimmunoassay Shock Injury

  白介素8(IL-8)是一种对中性粒细胞功能有重要调节作用的小分子量多肽 ,产生于有丝分裂刺激T淋巴细胞单核细胞成纤维细胞内皮细胞和表皮细胞 1。某些间皮细胞和角化细胞受IL-1TNF等因子刺激也能分泌IL-8IL-84种不同 的N末端变型,分别由77727069个氨基酸组成,在溶液中为二聚体2。 它主 要通过2受体发挥作用,在刺激趋化作用、调节补体受体表达和粘附分子的表达、促进血 管生成中有重要作用2。同时,作为对LPS应答初始反应的主要细胞因子IL-8 感染炎症中起重要的作用3,4。鉴于IL-8在血清中浓度非常微量,通常的分 析方法难有足够的灵敏度。我们建立的放射免疫分析技术,可灵敏地检出人和兔血清中IL-8 的正常值和异常情况下的变化,还能用于细胞培养上清中IL-8的分析,现介绍如 下。

  1 材料与方法

  1.1 材料 免疫用新西兰兔3(1.4 kg),免疫用豚鼠3(0.5 kg),实验 用大耳白兔52(2.5 kg)均为中科院动物所提供。人重组IL-8(北医大分子免疫室提供), 福氏完全佐剂和不完全佐剂(GIBCORL)A23187PMALPS和标准IL-8(Sigma)HL -60细胞(本室保存)125I标记物(原子能研究院),其它试剂均为国产分析纯。

  1.2 抗血清制备45 将纯化的IL-8 80 μg3 ml福氏完全 佐 剂充分混匀后免疫3只新西兰兔,另取30 μg IL-82.1 ml福氏完全佐剂充分混匀后免疫3 只豚鼠。每月1次,末次为加强免疫后第7天,放血分离血清保存于-20。兔和豚鼠分别免 疫 5次和4次,所获血清同125I标记抗原的结合率为50%时的最终稀释度为11.5×104 121.0×104

  1.3 抗原的标记16 将2 μg IL-8溶于0.2 mol/L pH7.5 磷 酸缓冲液30 μl,加入碘化钠0.5 mCi,立即加入氯胺T 10 μg(10 μl),混匀反应30 s后 加入偏重亚硫酸 20 μg (20 μl)终止反应;将所有反应体积加至相同缓冲液平衡的 色谱柱 ,用10 mol/L pH7.4磷酸缓冲液淋洗,1 min收集1管,同抗体反应后,取结合率高而非 特异低的管作为标记成功的IL-8,经3% BSA倍比稀释后分装保存于-20

  1.4 放射免疫分析16 将标准IL-8(0.20.61.2 2.44.89.6 ng/ml)和待测样品100 μl,同兔抗血清或豚鼠抗血清100 μl以及标记IL - 8 100 μl(20 000 cpm/min)混匀后于4放置24 h,加PR试剂(驴抗兔或羊抗豚鼠IgG抗 血 清和聚乙二醇的混合剂)500 μl,混匀后置室温下 15 min,经3 500 r/min离心15 min,弃 上清,测 定沉淀的放射性,经放免分析专用软件处理和计算各点结合率(B/B0%),绘制标准曲线并给 出样品的浓度。

  1.5 HL-60细胞培养上清中IL-8的测定 将对数生长期的大约106HL -60细胞放入24孔板,分别加入A23187(1 μmol/L)PMA(1 nmol/L)LPS(1 μg), 作用1361224 h,收集上清液贮存于-20待测。

  1.6 兔失血性休克再灌注复苏后血清中IL-8的测定7 经无菌分离动脉放血造成失血休克60 min,再灌注所放出的抗凝血液及平衡液,造成失血性休克再 灌注损伤,分别取损伤后30 min2 h6 h24 h各时间点动物血清和伤前自身血清。贮存待测。

  1.7 正常人血清的分离和培养 取正常查体者血清64人份,贮存待测。

  2 结果

  2.1 方法学研究

  2.1.1 标准曲线 在IL-80.29.6 ng/ml之间,兔和 豚鼠的抗血清能形成良好的线性关系。见图1

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1 白介素8放射免疫分析标准曲线

  Fig.1 The standard curve of IL-8 radioimmunoassay

  2.1.2 灵敏度和精密度 按B0±2s计算,最小可测值为0.1 ng/ ml。 另外,一次测定3例人血清各6份,批内CV为小于5%,一份样品分别测5次,批间CV9.6%

  2.1.3 特异性和准确性 2种抗血清同TNFIL-1IL-2IL-6 GM- CSF25200 ml/P1范围内均无交叉反应。分别在每毫升血清中加入0.31.24.6 ng I L -8标准后,回收率为95.4%109.0%,取IL-8含量较高的血清以及标准IL-8(Sigma)1/2 1/32的倍比稀释,测定值和稀释倍数间有良好的线性关系。

  2.2 正常人血清中IL-8水平 健康人血清中IL-8的平均值为(0.35±0.01 )ng/ml

  2.3 HL-60细胞培养上清液中IL-8的测定 如表1所示HL-60细胞在体 外培 养过程的124 h内,血清中IL-8水平逐渐增高,钙离子载体A23187LPS存在情况 下,可促进HL-60细胞释放IL-8。蛋白激酶阻断剂PMA(佛波脂)不能促进IL-8的释放。

1 A23187PMALPS体外刺激HL-60细胞后不同时间上清液中IL-8水平(ng/ml)

  Tab.1 The IL-8 level of culture supernatant

  in HL-60 cell stimulated b y A23187,PMA and LPS

  at different time in vitro(ng/ml)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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1 h

3 h

6 h

12 h

24 h

Control

(n=6)

0.32±0.04

0.54±0.07

0.62±0.05

0.92±0.07

1.15±0.24

A23187

(l μmol/L)

0.33±0.04

0.61±0.09

0.89±0.071)

1 .30±0.091)

2.78±0.091)

PMA

(l nmol/L)

0.28±0.07

0.37±0.09

0.45±0.07

0.82±0.05

1.13±0.15

LPS

(l μg/ml)

0.29±0.10

0.59±0.04

0.97±0.051)

 

1.92±0.08 1)

  Note:Compared with control,1)P0.01,by t test

2.4 兔失血性休克再灌注复苏后血清IL-8的变化 同伤前自身对照血样相 比较,兔失血性休克再灌注复苏后30 min IL-8开始显著上升,于复苏后2 h达最高,6 h 仍明显高于伤前水平,第24 h即恢复到正常水平,如表2所示。

2 兔失血性休克再灌注损伤后不同时间 血清中IL-8水平

  Tab.2 The IL-8 level of rabbit serum after hemorrhegic shock

  and repe rfusion injury at different time point

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n

IL-8

t val ue

P value

Pre-injury

52

0.559±0.222

30 min

52

0.828±0.3541)

4.826

0.001

 2 h

52

0.925±0.3781)

6.268

0.001

 6 h

52

0.850±0.4051)

4.737

0.001

24 h

40

0.651±0.321

1.678

0.05

  Note:Compared with the pre-injury group,1)P0.001,by t test3 讨论

  IL-8一种首先发现于LPS刺激人单核细胞后释放的10 kD多肽,被称为中性粒细胞激活 因子,在感染和炎症过程中发挥重要作用。由于正常人血清和体液中IL-8含量极低,一般 的免疫方法不能检测出其水平。国外目前有高灵敏的酶联免疫分析技术,但药盒售价不适 于国内的广泛使用。我们通过人工重组的IL-8免疫兔和豚鼠,获得了高特异性和高滴度的抗 血清。在此基础上,采用125I标记IL-8,建立了高灵敏度的放免分析方法。经过多 种条件的摸索,确定以平衡法,4温育24 h,最后加PR试剂分离游离和结合的抗原成份, 可获得良好的实验结果。同时,我们还对标记抗原、标准抗原以及抗体进行了室温、4和 冷冻干燥后保存的各种实验,确定碘标记抗原在冷冻干燥后于室温能保持2个月,标准抗原 和抗 体冻干后在室温下可放置半年,-20下置放2年都能保持良好的曲线形态。为验证该方 法的 可靠性,我们分析了64例正常人血清均能测出IL-8含量,平均值位于标准曲线的第1和第2 点之间。在HL-60细胞体外培养加外源性刺激实验中,证明LPS和钙离子载体A23187 能 明显促进HL-60细胞释放IL-8,表明该方法可灵敏检测细胞培养上清液中IL-8水平的差异 。 另外,IL-8分子的构成在不同种属之间有很强的同源性,也就是说抗人IL-8的抗体也能同 其它哺乳类动物的IL-8交叉反应2。为此,我们又测定了兔失血性休克再灌注 复苏后不同时间点和伤前自身对照血清IL-8的浓度,但此时使用的是豚鼠的IL-8血清,不 能使用兔IL-8抗血清,同时,分离剂PR试剂中所含的第二抗体也必须是驴抗豚鼠IgG的抗体 。结果显示损伤后兔血清中IL-8水平30 min即显著上升,2 h达高点,然后逐渐下降恢复于 正常水平。该结果表明:该法可用于兔血清中IL-8含量变化的检定;IL-8于失血性休 克再灌注损伤中的迅速上升可能同其激活和趋化中性粒细胞有关,同前期文献中报道的烧伤 病人血清中IL-8初期即明显升高及中性粒细胞激活相一致45

  总之,该法介绍了一种实用、简便、灵敏和特异的血清及培养液中IL-8的免疫分析方法, 对今后继续探讨IL-8在感染、炎症以及创伤休克机理方面提供了一种可靠的新手段。

  本课题为国家自然科学基金资助项目(No.39770716)

  作者简介:颜光涛,男,39岁,研究员,硕士生导师,主要从事炎症机理研究

  4 参考文献

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  3Gill E A,Imaizumi T,Corveth H et al.Bacterial LPS induces e ndothelin cells to synthesize a degranulating factor for nutrophils. FASEB J,199 8;12(9):673

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  6,郝秀华,颜光涛,王录焕 et al.I型磷脂酶A2放射免疫分析及初步 应用.中国免疫学杂志,199511(6)368

  7,颜光涛,郝秀华,王录焕 et al.失血性休克再灌注损伤时磷脂酶2及其水解产物的变化.中国病理生理杂志,199814(4)141

[收稿1999-08-17 修回1999-11-10

编辑:张湔  来源:中国免疫学杂志  浏览次数:0 发布时间:2014-03-19 14:52:00