抗肌红蛋白单克隆抗体的制备与鉴定及其初步应用

杨超一1,2,张雪峰1,2,李子颖3,冯婷婷1

(1.原子高科股份有限公司,北京 1024132.中国原子能科学研究院,北京 1024133.中国同辐股份有限公司,北京 100045)

 

摘要:目的 制备和鉴定抗肌红蛋白(Mb)单克隆抗体,为人肌红蛋白检测试剂的研制奠定基础。方法  用人肌红蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术进行细胞融合,用ELISA方法筛选,有限稀释法进行克隆化培养阳性杂交瘤细胞株。ELISA法测定小鼠腹水滴度,CLIA法对抗体进行配对实验与特异性鉴定。结果  筛选培养出9株分泌抗肌红蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,腹水滴度为1:5×1041:2×105。通过配对实验,有5株抗体6种组合可以成功配对。这5株抗体的亲和常数为6.46×1083.68×109L/mol。用5株抗体所建立的6种化学免疫分析方法与人Hb交叉反应率为7.434×10-3%2.904×10-2%,与人ALB交叉反应率为4.980×10-7%3.830×10-5%。用Mb17B6Mb21E8两株抗体建立的CLIA标准曲线的线性系数为0.997,灵敏度为6.02ng/mL。结论  成功制备了可以应用于免疫分析的抗肌红蛋白单克隆抗体。

关键词:肌红蛋白;单克隆抗体;酶促化学发光免疫分析;酶联免疫分析

Preparation and Characterization of Monoclonal Antibody Against Myoglobin

YANG Chao-yi, ZHANG Xue-feng, LI Zi-ying, FENG Ting-ting

HTA Co. LTD, Beijing 102413, China

Abstract: Objective To prepare and characteriz the monoclonal antibody against Mb to provide basis for the development of Mb diagnostic reagent. Methods BALB/c mice were immunized with human myoglobin (Mb) antigen, the positive hybridoma were obtained by using hybridoma cell technique. The characterization of antibody were determined by ELISA. Results Nine monoclonal antibodies against Mb were prepared. The titers of ascites were 1:5×1041:2×105. Five monoclonal antibodies successfully formed six anatibody pairs. The affinity constants of five monoclonal antibodies were in the range of 6.46×108 to 3.68×109 L/mol. The cross-reaction ratios with HB and ALB were 7.434×10-3%2.904×10-2% and 4.980×10-7%3.830×10-5% respectively. Two monoclonal antibodies (Mb17B6 and Mb21E8) were used to develop the chemiluminescence immunoassay. The assay sensitivity was 6.02 ng/mL. Conclusion The monoclonal antibodies against Mb are prepared successfully for the development of immunoassay.

Key wordsMyoglobinMonoclonal antibodyChemiluminescence immunoassayEnzyme-linked immunosorbent assay

 

人肌红蛋白(Mb)是国际上公认的早期诊断急性心肌梗塞的标志物之一,主要存在于肌肉中,起到运载氧分子的作用。相对分子量为17800道尔顿。正常情况下,血液中Mb的含量较低,而当心肌受到损伤时,可直接快速进入血液循环,12h升高,12h达高峰,24h后逐渐下降。因此血清中Mb的测定被用于急性心肌梗塞的早期诊断[1-4]。目前肌红蛋白抗体及相关诊断产品已有市售,但多为进口,且价格昂贵,不利于普及应用[5-6]。因此,肌红蛋白单克隆抗体的研制,为研发快速、高效的相关诊断试剂盒奠定了基础。

材料和方法

1   材料

BALB/c小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所;肌红蛋白(Mb)抗原为Life Diagnostics INC产品;福氏佐剂、DMEM、谷氨酰胺、HATHTPEG、降植烷等均为Sigma公司产品;胎牛血清(FBS)为吉泰生物科技有限公司产品;96孔与24孔细胞培养板、细胞培养瓶、离心管、酶标板、化学发光板等均为Costar公司产品;辣根过氧化物酶为北京博奥森生物技术有限公司产品;Protein-G亲和层析柱为GE公司产品。实验所用化学试剂均为分析纯。化学发光检测仪(1420 Multilabled Counter)为芬兰Wallac公司产品;酶标检测仪为美国Bio-Rad公司产品。

2   方法

2.1 小鼠免疫以及抗血清滴度的测定  用肌红蛋白抗原免疫68周龄的BALB/c雌性小鼠,采用常规颈背部皮下多点注射的方法进行免疫。基础免疫剂量为30µg/只,加强免疫剂量为2µg/只,经4次加强免疫后,小鼠眼底取血测定抗血清滴度。采用酶联免疫分析法测定,在已包被好肌红蛋白抗原的酶标板中,每孔加入100µL系列稀释浓度的Mb抗血清,置于37℃反应1h,洗涤3次后,每孔再加100µL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗,置于37℃反应0.5h,洗涤拍干后加底物溶液100µL37℃显色15min,加入50µL 2.0mol/L的硫酸终止反应,测定OD450nm值。

2.2 杂交瘤细胞株的建立  取抗血清滴度高的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)在50PEG作用下融合。融合后的细胞置于HAT培养基中,铺于含有饲养细胞(巨噬细胞)的96孔板中,于37℃、5 CO2培养箱中培养。融合后78天,待杂交瘤细胞长至1/4孔大小时,取细胞上清液,采用ELISA方法进行筛选。通过有限稀释法,对筛选的阳性杂交瘤细胞株进行克隆化,待克隆后细胞长至1/4孔大小时进行再筛选、再克隆化,直至克隆化的所用细胞经筛选后均为阳性为止。

2.3 小鼠腹水诱发及抗体纯化  将正常BALB/c小鼠腹腔注射降植烷(0.5mL/只),一周后,将已扩大培养的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔(5×105/只),一周后收集腹水,经2500rpm离心20min,取上清备用。采用Protein-G亲和层析柱对腹水进行纯化,获得的抗体对0.02mol/L pH7.4 PB 4℃透析,紫外分光光度计测定抗体浓度,分装后-20℃保存备用。

2.4 抗肌红蛋白单克隆抗体配对实验  采用酶促化学发光免疫分析法,对获得的9株抗Mb单克隆抗体和本实验室购买的2株进口抗Mb单克隆抗体进行配对实验。分别对每株抗体进行标记和包被,然后采用双抗体夹心法对每种组合进行酶促化学发光免疫分析实验,观察结合情况并制作标准曲线,观察标准曲线的信噪比和曲线线性相关系数。

2.5 抗肌红蛋白单克隆抗体的初步鉴定  小鼠腹水滴度的测定:采用ELISA法对获得的Mb6F59株抗体腹水滴度进行测定,实验方法同小鼠抗血清滴度测定。② Mb17B65株抗体亲和常数的测定[7]:采用非竞争性ELISA法,先向已包被好1:2:4抗原的酶标板中加入已稀释好系列浓度的Mb抗体,温育后洗涤,再加入一定稀释度的酶标记的驴抗鼠IgG抗体,反应后洗涤、显色、终止。通过不同包被浓度Mb条件抗Mb结合反应曲线OD50%处的抗体浓度,根据公式K=n-1/2(nAb-Ab),计算亲和常数。③ Mb17B65株抗体的特异性鉴定:用已灭活的小牛血清(零标准)对高浓度人血红蛋白(Hb)与人白蛋白(ALB)进行系列稀释,并作为样品在6种配对抗体建立的标准曲线中进行测量,计算其交叉反应率。④ Mb17B6Mb21E8酶促化学发光免疫分析程序:选用两株自制的抗Mb单克隆抗体Mb17B6C8Mb21E8,在包被有Mb21E8抗体的化学发光板中,每孔加入100μL标准品和100μL酶标记Mb17B6抗体,混匀后置于37℃反应1h;弃去反应液,用洗涤液洗板5次(250µL/孔),拍干;然后每孔加入200µL新鲜配好的发光液,静置1min后,检测化学发光计数值;以标准品浓度为横坐标,化学发光计数值为纵坐标,采用双对数作图法绘制标准曲线并拟合线性回归方程。

   

1   小鼠抗血清滴度的测定

ELISA法测定,用于小鼠抗血清滴度为1:10001:5000

2 抗肌红蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

进行9次细胞融合,经筛选、克隆化培养获得Mb6F5Mb17B6Mb19D3Mb21E8Mb23D5Mb29C8Mb29H8Mb31C8Mb32G69株分泌抗Mb单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

3   抗肌红蛋白单克隆抗体配对实验

9次融合后共获得9株抗Mb单克隆抗体,加上本实验室购买的2株抗Mb单克隆抗体,共11株抗体。分别对每株抗体进行包被和标记,采用酶促化学发光分析方法共做配对实验110种组合,其中有45种组合抗体能够结合。在自制的9株抗体中,有35种组合抗体可以配对,其中有6种组合抗体结合性相对较强,标准曲线的信噪比和曲线相关系数均较好,可用于免疫分析。实验结果见表1与表2

配对实验抗体结合情况

\

6F5

17B6

19D3

21E8

23D5

29C8

29H8

31C8

32G6

7C3

4E2

6F5

/

+

++

+

-

-

+

+

+

-

-

17B6

+

/

++

+++

-

-

+

++

++

+

-

19D3

+

+

/

+

-

-

-

+

+

-

-

21E8

++

++

+

/

-

-

-

+++

+++

++

-

23D5

-

-

-

+

/

-

-

++

++

+

-

29C8

-

-

-

-

-

/

+

+

+

+

-

29H8

-

-

-

-

-

+

/

+++

+++

-

-

31C8

+

-

-

++

-

-

-

/

-

+

--

32G6

-

-

-

-

-

-

-

-

/

-

-

7C3

-

-

-

-

-

-

-

-

-

/

-

4E2

++

++

++

+++

-

-

-

+

+

+++

/

 

注:“-”表明两株无结合,即不能配对;“+”表明两株抗体能结合,但结合较弱;“++”表明两株抗体能结合,但结合能力中等;“+++”表明两株抗体结合能力相对较强

2  6种配对抗体酶促化学发光分析的主要参数

配对抗体

信噪比

曲线相关系数

包被          标记

Mb21E8

Mb17B6

4.14

0.997

Mb21E8

Mb31C8

2.95

0.995

Mb31C8

Mb21E8

3.88

0.997

Mb31C8

Mb29H8

5.70

0.994

Mb32G6

Mb21E8

3.70

0.995

Mb32G6

Mb29H8

5.72

0.992

 

4   抗肌红蛋白单克隆抗体的初步鉴定

4.1 小鼠腹水滴度的测定  ELISA方法测定,Mb6F59株小鼠抗体腹水滴度为1:5×1041:2×105

4.2   Mb17B65株抗体亲和常数的测定   采用非竞争性ELISA法,测定不同包被浓度Mb条件抗Mb结合反应曲线。通过作图法取其最大OD值一半(OD50%)处对应的抗体浓度,根据公式K=n-1/2(nAb-Ab),计算Mb17B6Mb21E8Mb29H8Mb31C8Mb32G6抗体的亲和常数分别为6.46×1081.44×1092.84×1092.80×1093.68×109L/mol

4.3 Mb17B65株抗体的特异性鉴定  用已灭活的小牛血清(零标准)对高浓度人Hb与人ALB进行系列稀释,并作为样品在6种配对抗体建立的标准曲线中进行测量,通过计算得出用Mb17B65株抗体所建立的6种化学免疫分析方法与Hb的交叉反应率为7.434×10-3%2.904×10-2%,与ALB的交叉反应率为4.980×10-7%3.830×10-5%

5   Mb17B6Mb21E8酶促化学发光免疫分析标准曲线与灵敏度

选用Mb17B6抗体用于标记辣根过氧化物酶,Mb21E8抗体用于包被化学发光板,建立了Mb酶促化学发光免疫分析方法的标准曲线,见图1

 

1   Mb酶促化学发光免疫分析标准曲线

线性回归方程为Y=1.16X+3.23,相关系数r=0.997。同时检测20个“零”标准的发光计数值(cps,求出 +2SD值,并将此值代入标准曲线方程,求出对应的浓度为6.02ng/mL,即为本方法的灵敏度。

 

   

肌红蛋白是诊断急性心肌梗塞最灵敏和特异的标志物之一,临床应用广泛。本文采用杂交瘤细胞技术,经细胞融合、筛选、克隆化培养以及小鼠腹水的诱发共获得Mb6F59株抗肌红蛋白单克隆抗体。通过配对实验,6种配对抗体结合性相对较强,而且标准曲线的信噪比和曲线相关系数均较好,可用于免疫分析。经鉴定,抗体滴度为大于1:5×104。用于建立免疫分析方法的Mb17B65株抗体的亲和常数均大于6.46×108L/molMb17B65株抗体所建立的6种免疫分析方法与HbALB均没有显著交叉,说明用于建立免疫分析方法的5株抗体均具有较强的特异性。因此,本文制备的Mb17B65株肌红蛋白单克隆抗体可用于免疫分析,本研究选择Mb17B6Mb21E8两株抗体建立了酶促化学发光免疫分析标准曲线,而且灵敏度较好,为后续工作中研发肌红蛋白相关诊断试剂奠定了基础。

参考文献

[1] Iqbal M P, Kazmi K A, Mehboobali N, et al. Myoglobin--a marker of reperfusion and aprognostic indicator in patients with acute myocardial infarction.Clin Cardiol, 2004, 27(3):144-150.

[2] 沈振芳,沈昊,沈国荣.脑钠肽、肌红蛋白及肌钙蛋白Ⅰ联合测定对早期诊断急性心肌梗死的临床意义.临床军医,2012,40(1):94-96.

[3] 刘宏伟,仲伟强,王俊朝,.血清肌红蛋白快速酶免疫分析诊断急性心肌梗死.标记免疫分析与临床,2001, 8(2):92-95.

[4] 王奕忠,陈永丰,杨宏生.血清肌钙蛋白T和肌红蛋白测定在急性心肌梗塞患者早期诊断中的意义.河北医学,2010, 16(5):524-525.

[5] 王志峰,梁勇.肌红蛋白测定对早期心肌损伤的诊断价值.黑龙江医学,2011,35(11):861-863.

[6] Eggers K M, Oldgren J, Nordenskjöld A, et al. Diagnostic value of serial measurement of cardiac markers in patients with chest pain: limited value of adding myoglobin to troponin I for exclusion of myocardial infarction. Am Heart J, 2004,148 (4):574-581.

[7] 徐志凯.实用单克隆抗体技术. 西安: 陕西科学技术出版社,1992,86-88.

 

(李英丽编辑)

编辑:檀叶青  来源:标记免疫分析与临床  浏览次数:0 发布时间:2015-03-26 10:19:47